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内容来源：北京东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-12-03

设计sirna的网站

直播预告｜解码siRNA：药物设计优化策略与体外药效评价精讲

揭秘DDX1与ATM，探索A-T奥秘 𐟔 实验目的：本实验旨在探究DDX1是否在ATM的调控下参与A-T患者成纤维细胞对氧化应激的响应。 𐟓Š 实验设计思路： 2.1 比较研究：通过比较A-T患者成纤维细胞（ATM基因突变）和正常成纤维细胞在氧化应激条件下的表现，来评估ATM和DDX1的功能。 2.2 功能丧失研究：通过敲低（siRNA技术）DDX1和ATM，研究它们在氧化应激中的单独和联合作用。 𐟏�ꌦ�ꤥ’Œ方法： 3.1 细胞培养和氧化应激诱导：细胞模型：使用A-T患者成纤维细胞（AT2BE和AT3BI）和正常成纤维细胞（GM38和GM10）。氧化应激诱导：使用钠砷酸盐（arsenite）处理细胞，模拟氧化应激条件。 3.2 DDX1和ATM的敲低：使用siRNA技术敲低DDX1和ATM，以研究它们在氧化应激中的作用。 3.3 ROS水平测量： ROS测量：使用H2DCF-DA和MitoSOX-Red荧光探针来定量细胞内ROS水平，评估氧化应激的程度。 3.4 RNA免疫沉淀（RIP）： RIP实验：利用抗DDX1抗体进行RNA免疫沉淀，以捕获与DDX1结合的RNA。 qRT-PCR分析：对沉淀的RNA进行qRT-PCR分析，以确定DDX1靶标RNA。 3.5 细胞存活和死亡分析： TUNEL实验：检测细胞凋亡。克隆形成实验：评估细胞在氧化应激后的长期存活能力。 3.6 细胞分离和RNA及蛋白水平测量：细胞分离：分离细胞质和核提取物，以测量特定RNA和蛋白的水平。 3.7 统计分析：使用Student’s t-test进行数据分析，以确定实验结果的统计显著性。 𐟓ˆ 实验结果预期： DDX1和ATM的功能：预期在ATM缺失的细胞中，DDX1对其靶标RNA的保护作用会减弱，导致细胞在氧化应激下的存活能力下降。氧化应激响应：预期在ATM和DDX1敲低的细胞中，ROS水平会升高，细胞死亡会增加。 𐟎ꌦ„义：通过这些实验，研究者能够揭示ATM和DDX1在A-T患者细胞中对抗氧化应激的复杂作用，以及这种作用如何影响细胞的生存和功能。这个实验设计通过多角度、多步骤的方法，全面评估了ATM和DDX1在氧化应激中的作用，为理解A-T的病理机制提供了重要的实验数据。

信息产生和利用的核心信息是意识的基础之一，与意识有密切的关系。那么，信息产生和利用的核心是什么呢？本文尝试解开。生物出现以前，无所谓信息。自从承载遗传信息的RNA DNA产生后，生物便开始不自觉地使用信息。RNA DNA不仅本身是一个“信使”，而且还通过对蛋白质结构的调节，使生物具有了接收、储存、处理信息的能力。换句话说，RNA DNA不仅本身传递信息，而且还为生物设计了接收信息的形式和种类，以及利用信息的形式。 1. 信息的起源在生物出现之前，信息的概念并不适用，因为信息通常涉及某种形式的编码、传输和解码，是生物特有的功能。随着RNA和DNA的出现，生物开始能够存储和传递遗传信息，这是信息利用的起点。 2. RNA和DNA的“信使”作用遗传信息的传递。RNA和DNA通过其核苷酸序列编码遗传信息，这些信息指导生物体的生长、发育和功能。DNA中的遗传信息通过转录过程生成mRNA，mRNA再通过翻译过程在核糖体上生成特定的蛋白质。蛋白质结构的调节。RNA（特别是mRNA）将DNA中的遗传信息传递到核糖体，通过翻译过程生成特定的蛋白质。这些蛋白质执行各种生物功能，如酶催化、信号传导、结构支持等。此外，非编码RNA（如miRNA和siRNA）也在基因表达调控中发挥重要作用，进一步影响蛋白质的合成和功能。 3. DNA信息利用的机制接收信息。生物通过感受器和受体蛋白感知环境变化，这些变化可以通过信号传导途径传递到细胞核，影响基因表达。例如，光感受器可以感知光照强度，温度感受器可以感知温度变化，化学感受器可以感知化学物质的存在。储存信息。DNA的双螺旋结构提供了稳定的遗传信息存储方式，确保信息在细胞分裂和世代传递中保持完整。DNA的高保真复制机制保证了遗传信息的准确性，使生物能够将遗传特征传递给后代。处理信息。转录和翻译过程将DNA中的信息转化为功能性蛋白质，这些蛋白质参与细胞的各种代谢和调控过程，使生物能够适应和应对环境变化。此外，表观遗传学机制（如DNA甲基化和组蛋白修饰）也在基因表达调控中发挥重要作用，影响生物对环境的响应。 4. 宏观视角的信息利用宏观上，信息利用的机制更容易理解。人类由DNA调节控制的功能性蛋白质，形成了大脑神经系统。该系统在生存目的的驱动下，把先天和后天的信息进行加工（即意识），以获得更适应自然而生存的信息。例如，人类的大脑可以处理视觉、听觉、触觉等多种感官信息，通过学习和记忆，形成复杂的认知和行为模式。小结 RNA和DNA在生物信息利用中，不仅是遗传信息的载体，还设计了生物接收、储存和处理信息的方式，从而使生物能够在复杂的环境中生存和繁衍。从微观的基因表达调控到宏观的大脑神经系统，信息的产生和利用贯穿了生物的整个生命周期，体现了生命系统的复杂性和精妙性。RNA和DNA从而也成为信息产生和利用的核心。 #三分钟讲科普#

siRNA 转染效率不理想，背后原因是什么？

一分钟搞懂基因过表达、敲低、敲除的区别嘿，大家好！今天咱们来聊聊基因操作里的三个常见术语：过表达、敲低和敲除。别担心，只需要一分钟，你就能搞懂它们的区别啦！基因过表达 𐟚€ 基因过表达，简单来说，就是把一个基因插到一个表达载体里，然后把这个载体转染到目标细胞里。这样一来，细胞就会大量表达这个基因和它编码的蛋白质。常见的载体有哺乳动物载体（用于人、小鼠等哺乳动物细胞）、原核载体（用于大肠杆菌等原核生物）和慢病毒载体（比如HIV、FIV、SIV、EIA）。构建这些载体的方法包括设计目的基因片段和载体、连接元件（用酶切或gateway连接），然后通过病毒载体、电穿孔或转染试剂导入目标细胞。基因敲低 𐟛‘ 基因敲低呢，主要是用抑制剂来抑制基因的表达。常见的方法有RNA干扰技术（RNAi）、CRISPR-Cas9技术和gene转染技术。比如，siRNA载体通过与目标mRNA互补结合序列，特异性地实现靶向mRNA降解。而CRISPR载体则包含CRISPR靶向序列和转录抑制子。构建这些载体的步骤包括设计干扰序列、合成和克隆、转化和筛选，最后通过病毒等途径导入目标细胞。基因敲除 ✂️ 基因敲除则是用含有已知序列的小DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合到受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。常见的载体有CRISPR/Cas9载体和TALENs载体。CRISPR/Cas9载体通过Cas9核酸酶和sgRNA靶向序列精确定位并靶向基因DNA序列，然后引入双链断裂点，完成基因敲除。而TALENs载体则包含特异性核酸酶和nuclease binding domain，通过切割靶向基因DNA序列，完成敲除和编辑。构建这些载体的方法包括设计和选择靶点、载体插入、转化和验证，最后通过病毒载体、电穿孔等方法导入目标细胞。总结 𐟓 总的来说，基因过表达、敲低和敲除这三种技术在生物学研究中有着广泛的应用。了解它们的原理和构建方法，可以帮助你更好地设计和执行实验。希望这篇文章能让你在短时间内对它们有个清晰的认识！如果你有任何问题或需要进一步的解释，欢迎在评论区留言哦！𐟘Š

siRNA转染实验步骤及要点详解 siRNA转染步骤：以EpFed转染试剂转染siRNA/质粒于24孔板，siRNA浓度为50nM为例。 1）储存液准备：siRNA使用前瞬时离心，用RNase-free H2O或灭菌ddH2O配制成20/L储存液，分装保存，避免反复冻融（建议不超过5次）。 2）细胞接种：贴壁细胞：转染前24小时接种0.5 - 2㗱05个细胞，转染时细胞融合度为30 - 50%。（铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长）悬浮细胞：转染前24小时接种0.5 - 2㗱05个细胞，转染时细胞数量应在4 - 8㗱05/孔。 3）转染步骤： A. 用25 ⵌ Opti-MEM（或不含抗生素和血清的DMEM培养基）稀释1.25⵬ siRNA（20/L储存液）/500ng质粒，并用枪轻轻吹打3 - 5 次混匀，再加入1.0 ⵌEpFed转染试剂，用枪轻轻吹打3 - 5 次混匀，不可Vortex或离心。siRNA转染细胞的终浓度为50 nM，室温孵育20分钟。 B. 按照24孔板每孔25ⵌ转染试剂-siRNA/质粒混合物，均匀加入到24孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。 C. 细胞板置于37℃、5% CO2培养箱中培养48-72小时。对于某些细胞对EpFed转染试剂比较敏感，可以在转染后4-6小时更换细胞培养液，转染效率无显著影响。 4）效果检测：转染完成后48-72小时均可进行沉默/过表达效果检测，最佳检测时间与细胞类型、转染试剂、检测目的等相关。 siRNA基因沉默效率的常见测定方法和注意事项： QPCR检测：优先推荐QPCR检测RNA水平的沉默效果，推荐在24h到48h检测，可适当调整。QPCR检测沉默效果时，在设计引物时最好是将引物设计在沉默位点（靶序列）的两侧，而不是在同侧。因为RNAi引起的沉默是先进行mRNA的切割之后造成mRNA的降解。另外，即使设计在两侧，也不要离沉默位点（靶序列）太远的地方，不然可能会造成对沉默效果的低估。 WB检测：WB检测蛋白水平的沉默效果，一般在转染后48h到72h间提蛋白检测蛋白水平的沉默效果，检测时间跟目的蛋白的半衰期也有关系，具体的时间需要设计时间梯度，一般理想的是在72h最明显。

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