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内容来源：北京东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-11-27

rnai引物设计网站

circRNA实验全解 𐟔 实验原理在组织或细胞中提取的total RNA通常包含多种RNA。为了准确分析circRNA，首先需要去除样本中的核糖体RNA和poly-A RNA干扰，然后用RNase酶消化掉线性RNA，从而使circRNA富集。 𐟓Š 实验目的从总RNA中富集circRNA，采用Northern blot和特异的PCR进行验证，并对circRNA的成环特性进行评估。 𐟧ꠥꌦ料 RNA提取试剂盒核糖体RNA去除试剂盒 PolyA结合磁珠 RNAaseR试剂盒放线菌素D Northern blot试剂盒发散引物RT-PCR 𐟓 实验步骤 4.1 RNA提取样品处理组织样品：加入400ul Trizol溶液到装有绿豆大小组织块的EP管中，利用电动组织匀浆器在冰上充分匀浆1-2min，后放置室温充分裂解10min。细胞样品：12孔板细胞弃去上清，每孔加入600ul Trizol溶液。先在冰上裂解15-20min，再用1ml移液枪吹打液体充分裂解贴壁细胞，后将液体转移到RNasefree EP管中。 RNA提取按1:5比例，在Trizol溶液中加入氯仿，手动充分摇匀混合液20-30s，室温放置10min。 4度1200g离心10min，小心转移上层透明液体到EP管中。按异丙醇与Trizol溶液比例为1:2加入异丙醇，上下颠倒混匀液体，室温放置10-15min。 4度1200g离心10min，弃去上清，可见羽毛状RNA沉淀于管侧底部。按等比例加入75%乙醇，温和地悬浮RNA沉淀。 4度7500g离心5min，尽量吸除上清，室温晾干5-10min。用20ul RNase free dH20溶解RNA，测浓度后-80度保存。总RNA定量 RNA在260nm波长处有最大吸收峰，可通过测定RNA样品的OD260和OD280估算出RNA的含量和纯度。OD260值为1相当于40ug/ml单链RNA，该方法提取的RNA OD260/280值在0.8-2之间。 circRNA的预处理去除核糖体RNA和poly-A RNA 使用Invitrogen的核糖体RNA去除试剂盒RiboMinusTM Human/Mouse Transcriptome Isolation Kit（货号K1550-01）。通过磁珠法结合Poly(A)的RNA后剩余的RNA即为Poly(A)-RNA样品。 RNAaseR酶消化 RNase R是一类核糖核酸外切酶，能降解大部分线性RNA，但circRNA不易被RNase R酶消化降解。因此可以通过该实验鉴别circRNA和线性RNA。准备总RNA样品：提取细胞或组织的总RNA，测浓度后备用。 RNaseR反应体系：取5ug total RNA样品按下面体系准备消化。短暂旋转试管，添加5xFirst-StrandBuffer, 0.1MDTT, RNasin和SuperScriptM RT，轻轻移液并将反应液在25℃下孵育5分钟。在50℃下孵育60分钟，然后通过灭活反应在70℃加热15分钟。发散引物可以扩增circRNA，而不能扩增线性RNA。 𐟓š 参考文献 Chen et al. (2015). Isolation of non-polyadenylated and ribosomal-free RNAs from mammalian cells. Methods Mol Biol 1206, 69-80. Yang et al. (2016). Characterization of Circular RNA. Methods Mol Biol 1402, 215-227.

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