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基因序列互补网站设计下载_基因工程经典例题及答案(2024年11月最新版)

内容来源：北京东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-11-28

基因序列互补网站设计

荧光原位杂交（FISH）技术全解析荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是一种利用荧光标记的核酸探针与目标序列进行杂交的技术。通过荧光显微镜观察荧光信号的位置和强度，可以实现对基因或染色体的精确检测和定位。 𐟔 原理 FISH技术基于核酸互补配对的特性。通过设计与目标DNA或RNA序列互补的探针，在特定条件下使探针与目标序列结合，再通过荧光显微镜观察杂交的结果。该技术可以实现单细胞水平的精确检测，具有高灵敏度和高特异性，因此在检测染色体异常、基因扩增、基因重排等方面有独特的优势。 𐟓 操作步骤样品制备样品制备是FISH技术中至关重要的一步，直接影响杂交的效果和信号的清晰度。根据研究目的的不同，样品可以是组织切片、细胞涂片或培养细胞。需要将样品固定在载玻片上，通常使用甲醇和乙醇混合液进行固定。固定的目的是保持细胞形态和核酸结构，同时使细胞膜通透，以便探针能够进入细胞内与目标序列结合。探针标记探针是FISH实验的关键组件，通常是寡核苷酸或cDNA。为了实现荧光检测，探针需要通过化学方法标记荧光染料，如FITC、Cy3、Cy5等。标记后的探针能够与目标核酸序列特异性结合，通过荧光显微镜观察探针位置来确定目标序列的存在和位置。杂交杂交是FISH技术的核心步骤。在杂交之前，样品通常需要经过预处理，包括DNA变性（通常在70-75Ⰳ的温度下处理，以使双链DNA解链成单链）和探针变性。变性后的探针与样品共同孵育，通常在湿润的条件下孵育数小时至过夜，使探针与样品中的目标序列结合。杂交后洗涤为了去除未结合的探针，需要在杂交后进行严格的洗涤步骤。这一步骤非常重要，可以显著减少非特异性结合的背景信号。洗涤通常在含有盐溶液的缓冲液中进行，具体的洗涤条件（如温度和时间）需根据探针的长度和杂交温度来调整。荧光显微镜观察杂交后，样品会被转移到荧光显微镜下进行观察。通过特定的滤光片，能够看到探针标记的荧光信号。通过比较荧光信号的位置和强度，可以判断目标序列的位置、数量以及其在细胞中的分布情况。常见的FISH应用包括染色体核型分析、基因扩增检测、和染色体重排等。结果分析最后一步是对获得的图像进行分析。通常，FISH结果以图像形式呈现，研究人员通过图像分析软件进行定量分析，例如测量荧光强度、统计荧光点的数量等。这些数据能够为研究提供有力的支持，并帮助科学家们做出准确的判断和结论。

PCR常见问题及解决方法全解析 PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应，是生物领域中最基础且重要的一环。它通过变性、退火、延伸等步骤，在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。 PCR反应体系中包含几个关键成分：模板（Template）：可以是基因组、质粒DNA、cDNA，甚至是细菌或组织样品。引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性，并确定引物长度。 DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的“机器”。缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，是DNA的基本组成元件。 Mg、K离子增强剂：增强PCR反应的效果。在实际操作过程中，PCR可能会遇到多种问题，如PCR产物条带拖尾、有杂带，甚至完全没有条带等。以下是一些常见问题及其原因：完全没有条带试剂质量问题或加样错误：导致反应体系不完整。模板DNA问题：模板与引物无法结合。引物或反应温度设计不合理：引物特异性差或退火温度不合适。有很多非特异性条带反应体系污染：反应体系被污染。引物特异性差：引物特异性差。退火温度不合适：退火温度不合适。目的条带弱聚合酶活性过低：聚合酶活性过低。循环次数偏低：循环次数偏低。模板DNA浓度过低：模板DNA浓度过低。 PCR产物出现片状拖尾 DNA聚合酶过多或酶活性差：DNA聚合酶过多或酶活性差。 dNTP和Mg离子浓度过高：dNTP和Mg离子浓度过高。退火温度过低或循环数偏多：退火温度过低或循环数偏多。模板DNA用量过大或模板不纯：模板DNA用量过大或模板不纯。引物特异性差或形成二聚体：引物特异性差或引物间形成二聚体导致非特异性扩增。了解了这些问题的原因后，就可以针对性地调整PCR条件，以获得理想的条带。希望这些信息能帮助大家在PCR实验中取得成功！

PCR反应体系详解：从引物到酶的选择 PCR反应的核心是扩增缓冲液、dNTP混合物、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶和Mg2+。以下是详细的介绍：引物 𐟧슥𜕧‰馘R反应的关键，决定了扩增的特异性。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就可以设计出互补的寡核苷酸链作为引物，从而在体外大量扩增模板DNA。设计引物时需要遵循以下原则：长度：15-30bp，常用20bp左右。扩增跨度：200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 G+C含量：40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免内部二级结构和引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度 𐟌€ 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP混合物 𐟧ꊤNTP混合物包括四种碱基：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C），各200umol/L。模板DNA 𐟓œ 模板DNA的量通常在0.1～2ug之间。 Mg2+ 𐟌 Mg2+的浓度通常为1.5mmol/L。反应体系 𐟏튥𐆤𘊨🰦‰€有成分加双或三蒸水至100ul，即可进行PCR反应。 PCR反应的五要素包括引物、酶、dNTP、模板和Mg2+，每个要素的选择和浓度都至关重要，直接影响PCR的结果。

荧光原位杂交（FluorescenceInSituHybridization，FISH）是一种利用荧光标记的核酸探针与目标序列进行杂交的技术，通过荧光显微镜观察荧光信号的位置和强度，从而实现对基因或染色体的精确检测和定位。 FISH技术的原理是基于核酸互补配对的特性，通过设计与目标DNA或RNA序列互补的探针，在特定条件下使探针与目标序列结合，再通过荧光显微镜观察杂交的结果。该技术可以实现单细胞水平的精确检测，具有高灵敏度和高特异性，因此在检测染色体异常、基因扩增、基因重排等方面有独特的优势。荧光原位杂交的操作步骤样品制备样品制备是FISH技术中至关重要的一步，直接影响杂交的效果和信号的清晰度。根据研究目的的不同，样品可以是组织切片、细胞涂片、或培养细胞。需要将样品固定在载玻片上，通常使用甲醇和乙醇混合液进行固定。固定的目的是保持细胞形态和核酸结构，同时使细胞膜通透，以便探针能够进入细胞内与目标序列结合。探针标记探针是FISH实验的关键组件，通常是寡核苷酸或cDNA。为了实现荧光检测，探针需要通过化学方法标记荧光染料，如FITC、Cy3、Cy5等。标记后的探针能够与目标核酸序列特异性结合，通过荧光显微镜观察探针位置来确定目标序列的存在和位置。杂交杂交是FISH技术的核心步骤。在杂交之前，样品通常需要经过预处理，包括DNA变性（通常在70-75Ⰳ的温度下处理，以使双链DNA解链成单链）和探针变性。变性后的探针与样品共同孵育，通常在湿润的条件下孵育数小时至过夜，使探针与样品中的目标序列结合。杂交后洗涤为了去除未结合的探针，需要在杂交后进行严格的洗涤步骤。这一步骤非常重要，可以显著减少非特异性结合的背景信号。洗涤通常在含有盐溶液的缓冲液中进行，具体的洗涤条件（如温度和时间）需根据探针的长度和杂交温度来调整。荧光显微镜观察杂交后，样品会被转移到荧光显微镜下进行观察。通过特定的滤光片，能够看到探针标记的荧光信号。通过比较荧光信号的位置和强度，可以判断目标序列的位置、数量以及其在细胞中的分布情况。常见的FISH应用包括染色体核型分析、基因扩增检测、和染色体重排等。结果分析最后一步是对获得的图像进行分析。通常，FISH结果以图像形式呈现，研究人员通过图像分析软件进行定量分析，例如测量荧光强度、统计荧光点的数量等。这些数据能够为研究提供有力的支持，并帮助科学家们做出准确的判断和结论

QuikChange法突变，详解！ QuikChange法适用于点突变（或相邻多个位点突变）、基因删除、小片段基因插入或替换。虽然其他步骤相同，但引物设计略有差异。以下是详细原理和操作方法：简要原理 𐟓œ QuikChange法相当于对整个质粒进行PCR（环P）。利用带有反向互补序列的引物，将整个质粒进行PCR扩增。PCR过程中，质粒形成环状，转化大肠杆菌后缺口被修补。实验方法 𐟧ꊤ𛥥Œ链质粒为模板进行PCR扩增（PCR退火温度根据引物确定，延伸时间根据整个质粒长度及DNA聚合酶确定）。模板量可以减少到1-5ng/50，循环数可减少至25-28个。 PCR条件示例 𐟔効5℃，5min，1循环 95℃，30s 60℃，30s 72℃，4min，25循环 72℃，10min，1循环 PCR后最好先跑胶确认有没有条带。虽然有很多人说PCR后没有条带也正常，转化依然可以长出菌落，但个人经验：如果无条带或者条带弥散，转化大概率不会长。 Dpn酶切 𐟔ꊦ‰饢ž产物用Dpn酶切去除甲基化的质粒模板。Dpn酶切条件示例： 10㗢uffer：2 DpnI：1 37℃孵育2小时。转化与验证 𐟧슥𐆩…𖥈‡后的产物转化DH5a/Top10感受态细胞，进行菌落PCR和测序验证。详细原理 𐟔스𛥨𔨧𒒄NA作为模板，在高保真聚合酶作用下，使用两条具有同源序列的引物引导DNA合成。两条引物内均含有预定突变位点，经过多轮热循环，双链质粒DNA的全长均以线性形式扩增。由于引物含有同源序列，最终产生DNA双链带交错缺口的突变质粒。经过高保真酶扩增而得到的DNA产物具有缺口，DNA链的磷酸二酯键并未闭合，非闭合环形质粒同样也能被大肠杆菌细胞吸收，断裂的缺口可在质粒进入感受态细胞内后被修补。甲基化修饰 𐟧ꊥŽŸ来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切开（Dpnl识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次）。而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。通过以上步骤，你就可以成功设计并操作QuikChange法突变引物啦！

构质粒90%成功的秘诀：超长引物的使用 𐟧젥ˆ学者都知道，引物设计有一条基本原则：引物长度不超过30bp，与目的基因互补序列15-20bp，以及3'端不能是GC等。但在实际操作中，我发现其实不需要严格遵守这些原则。现在的PCR酶效率非常高，退火温度用到70度完全没问题。 𐟧젦ˆ‘这里说的超长引物是指50-60bp，与目的片段互补序列或同源臂在30bp左右，退火温度直接用70度。这样的引物特异性非常好，与目的片段结合的效率很高，不容易形成引物二聚体，PCR几乎都能一次性成功。同源臂长重组效率也高，平板上长出来的菌大部分都是重组成功的，大大缩短筛选的时间。 𐟧젩‚㤹ˆ什么时候需要超长引物呢？ 1️⃣ 模板质量：如果模板是质粒，那么目的基因的浓度和纯度都非常好，互补序列在15-20bp之间都可以P出来（但依然有失败的概率，所以为了节省时间我都用长引物）。如果模板是cDNA，那么里面东西比较杂，浓度可能也不高，所以需要提高引物特异性，让它更容易捕捉到你的目的基因。 2️⃣ 引物容易形成二聚体：正反引物有不可避开的6-10bp的互补序列，可以通过延长引物的总长度，提高与目的基因结合的效率，避免引物二聚。 3️⃣ 同源重组失败：需要延长同源臂。 𐟧젥…𓤺Ž构质粒之前已经发过好几篇笔记，大家可以翻看。最近又收获了一些心得，我会进一步综合整理出来一个系列，希望对大家有帮助～

PCR引物设计指南：关键步骤详解 𐟓š 1. 𐟔 引物设计在保守区：选择模板cDNA的保守区设计引物，这是PCR成功的关键。通过在NCBI上搜索不同物种的同一基因，并使用序列分析软件（如DNAman）进行比对，找出基因的保守区。 𐟓 引物长度适中：引物长度通常在15~30碱基之间，推荐使用18-27bp，避免过长导致延伸温度过高，影响Taq DNA聚合酶的反应。 𐟌᯸ GC含量优化：引物的GC含量应在40%~60%之间，并确保上下游引物的GC含量相近。引物的Tm值（解链温度）应接近72℃，以提高复性条件。 𐟚렩🥅密码子第3位终止：如果扩增编码区域，引物的3′端不应终止于密码子的第3位，因为这可能会影响扩增的特异性和效率。 𐟏… 3′端选择T：引物3′端选择T比A更佳，因为T的错配效率较低，而A即使在错配时也能引发链的合成。 𐟌 碱基随机分布：引物序列在模板内应随机分布，避免3′端有连续的G或C，以减少错误引发的可能性。 𐟔„ 避免引物互补：引物自身及引物之间不应存在互补序列，以防止引物折叠成发夹结构或形成二聚体，影响PCR反应。 𐟔砨𐃦•𔢖𓇥€𜯼š如果引物二聚体和发夹结构不可避免，应尽量调整其△G值，使其小于4.5kcal/mol，以减少引物二聚体的产生。

引物设计在进行PCR、基因编辑等实验时，引物设计的成功与否至关重要。以下是设计PCR引物时需要注意的几个关键点： 𐟓 引物长度：引物的长度通常在15-30个碱基对（bp）之间，推荐长度为18-23个碱基对。过长的引物可能导致延伸温度超过74℃，不适合使用Taq DNA聚合酶。 𐟌᯸ GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，45-55%是一个不错的选择。过高的GC含量可能不利于引物的引发反应。 𐟌᯸ 退火温度：引物的退火温度应适中，以便在PCR过程中能够有效地与模板DNA结合。通常，退火温度应在55-65℃之间。 𐟔„ 避免自我互补：引物自身不应存在互补序列，否则可能会折叠成发夹结构，影响与模板的复性结合。引物之间不应有互补性，以防止引物二聚体的形成。 𐟔 特异性：设计完成后，应进行BLAST检测以确保引物的特异性，即只与目标基因序列结合，不与其他物种或其他序列中的相同序列结合。 𐟚렩🥅重复碱基：设计引物时，应避免重复碱基，尤其是G，因为这可能导致非特异性的扩增。 𐟓 PCR产物长度：引物的产物大小不宜过大，一般在80-250bp之间，80～200 bp最为合适。 𐟔„ 引物对齐：确保两个引物的退火温度相近，以便它们能够在相同的温度下结合到模板上。 𐟚렩🥅回文序列：引物中应避免出现回文序列，因为这可能导致非特异性的扩增。遵循这些准则，可以大大提高PCR实验的成功率。

PCR技术全解析：从基础到应用分子生物学实验室中，最基础且关键的实验之一就是PCR（Polymerase Chain Reaction），即多聚酶链式反应。通过PCR技术，我们可以在短时间内大量扩增特定的DNA片段。以下是PCR的基础知识、步骤和应用。 ❓PCR是什么？ PCR是一种利用DNA双链复制原理，在体外扩增特定DNA片段的核酸合成技术。它可以在短时间内大量复制目的基因。 ❓PCR需要什么？ PCR反应需要以下组成部分： 1️⃣ DNA模板：含有需要扩增的DNA片段 2️⃣ 引物：决定扩增的起始和终止位置 3️⃣ DNA聚合酶：复制需要扩增的区域 4️⃣ 脱氧核苷三磷酸：用于构造新的互补链 5️⃣ 含有镁离子的缓冲液：提供适合聚合酶行使功能的化学环境 ❓DNA引物如何设计？引物是人工合成的短DNA片段，通常不超过50个碱基（一般为15-30个），与所要扩增的DNA片段的起始和终止区域完全互补。设计引物的原则包括： ✔️ GC比例一般为40%-60% ✔️ 计算两个引物的Tm值（Tm值=4(G+C)+2(A+T)），使之不相差5℃，并且扩增产物的Tm与引物相差不超过10℃ ✔️ 黏合温度通常比计算的最低Tm低5℃ ✔️ 3‘末端十分重要，不能含有与其他引物互补的序列 ❓PCR包括哪几个步骤？ 1️⃣ 变性：利用高温使双链DNA分离，高温会将连接两条DNA链的氢键打断 2️⃣ 黏合：DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上 3️⃣ 延长：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链 ❓PCR技术有什么应用？ PCR技术广泛应用于基因分型（genotyping）、克隆（cloning）、诱变（mutagenesis）和测序（sequencing）等领域。有任何疑问，欢迎在评论区留言！

端粒酶如何防止染色体变短？在上一篇文章中，我们提到了真核生物的染色体末端会随着复制而不断变短。如果没有一种补救机制，这将会是一个大问题！那么，端粒的结构为我们提供了答案。分子生物学家伊丽莎白ⷥ𘃨Ž𑥅‹本（Elizabeth Blackburn）发现，染色体末端区域有专门的核苷酸序列，这些序列被整合到称为端粒的结构中。端粒包含许多短序列的串联重复序列，这在原生动物、真菌、植物和哺乳动物等各种生物中是相似的。在人类中，重复单位的序列是GGGTTA，它在每个端粒上重复大约一千次。布莱克本还发现，体细胞的染色体端粒区比生殖细胞短得多。她推测这是由于DNA复制时端粒中DNA的丢失。那么，连续分裂了几十年的生殖细胞是如何避免这种情况的呢？布莱克本和她的合作者杰克ⷧ𛍦–率”克提出细胞拥有一种端粒延长酶。1984年，布莱克本的研究生卡罗尔ⷦ 𜩛𗥾𗦈功分离出了这种酶——端粒酶。端粒酶有一个内部RNA作为模板。它通过合成与自身内部RNA互补的短DNA序列，产生在端粒中观察到的重复序列。这些重复序列的另一条链是由复制机制使用端粒酶产生的序列作为模板合成的。在人类中，端粒酶活性在胚胎和儿童发育期间很高，但在成人体细胞组织中很低。一些干细胞，特别是那些在一生中必须高速补充的组织中的干细胞——例如骨髓或肠道内壁，保留了完整的端粒酶活性。一种观点认为，我们的体细胞从胚胎开始就有完整的端粒重复序列。随着个体发育的进行，在大多数类型的细胞中，端粒酶的水平降低，因此该酶不能完全跟上染色体复制。这种细胞每次分裂时，每个端粒都会丢失100-200个核苷酸。在许多细胞世代之后，后代细胞将继承缺乏功能性端粒的染色体，并且由于这种缺陷，激活DNA损伤反应，导致它们永久退出细胞周期并停止分裂。这一过程称为复制性细胞衰老。理论上，这样的机制可以提供一个防止体细胞组织中异常细胞不受控制的细胞增殖，从而有助于保护我们免受癌症的侵害。比如，我们发现在大约90%的癌细胞中，端粒酶基因被重新激活，从而绕过了正常的安全机制。

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