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过表达载体引物设计网站解读_过表达载体引物设计网站推荐(2024年11月精选)

内容来源：北京东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-11-30

过表达载体引物设计网站

分子克隆实验指南：从零开始到成功大家好！首先，非常感谢你们的关注和喜欢，真的很开心我的笔记能帮到大家。还记得最开始的那篇笔记，记录了我那次离谱的分子克隆实验，4个片段的同源重组竟然花了两个月！后来我慢慢发现，分子克隆其实非常微妙，有点像高中时的数学，学霸们轻而易举考100分，而我这种小学渣每次都在及格边缘反复横踩。所以，我想用这个账号记录我的科研日常，希望能和大家一起学习。之前的几篇笔记中，我分享过引物设计、载体酶切、同源重组等非常具体的实验方法。但最近我发现，很多粉丝朋友们刚开启自己的科研之旅，或者是偏向临床的科研大佬们，对分子克隆实验整体了解比较少。所以今天，我想跟大家分享一下质粒构建的大体流程。明确你的目标 𐟎斥…ˆ，在构建质粒之前，你需要有一个清晰的计划。明确你要使用哪种克隆方法，比如同源重组、TOPO克隆还是T4连接。TOPO/TA克隆不需要同源臂，而同源重组和T4连接是需要同源臂的。选择合适的载体 𐟚€ 根据你的实验目的，选择合适的表达载体。例如，常用的原核表达载体有pET28a，真核表达载体有pcDNA3.1，CRISPR/Cas9表达载体有Lenti-V2等等。载体可以通过酶切或者环形PCR后，跑胶回收所需的载体片段。设计引物并扩增片段 𐟔슦 𙦍€选的构建方法，设计并合成引物。PCR扩增需要插入的目的片段，PCR的产物也需要通过跑胶回收。连接与转化 𐟔„ 将载体和目的片段连接后，转入合适的感受态细胞内。例如，DH5˜“产生突变或者缺失，而Stable3相对更加稳定。但提质粒时需要使用试剂盒中的去蛋白液洗3遍，以充分去除核酸酶，减少后续对质粒酶切等实验的影响。通常连接产物的用量不超过总体积的1/20。然后在冰上静止20分钟，热激1分钟，再冰上静置3分钟，加入无抗的LB培养基，摇床摇40-60分钟，最后涂在合适抗性的LB平板上。培养与鉴定 𐟧ꊌB板子放在37度培养箱内过夜生长，第二天挑取单克隆细胞，置于合适抗性的LB培养基中摇菌，然后提质粒送测序公司测序。如果你想偷懒的话，也可以直接送菌液到公司哦，菌液和质粒的测序价格是一样的。今天就分享到这啦，希望这些内容对大家有用！如果有什么问题或者要补充的，欢迎评论或者私信哦！𐟘Š

载体构建攻略𐟔犰Ÿ”젨𝽤𝓦ž„建全流程目的基因的扩增首先，从NCBI上找到目的基因的核苷酸序列，利用Snapgene设计引物。通常在序列的前后各选20-25bp作为上下游引物。先用普通MIX进行退火温度优化，然后使用高保真酶（如诺维赞的2X Phanta⮠Max Master Mix）进行50uL体系的扩增。若需要高浓度，可扩增两管。连接连接目的基因与载体可选择T4连接酶，需在目的基因两端设计酶切位点和保护碱基（注意这些位点不能出现在片段内，以免片段被内部切开）。也可选择无缝克隆方式，利用同源重组原理，在引物5'端加入载体的同源臂，引物顺序为同源臂+酶切位点+基因引物。我个人偏爱这种方式，省时方便。本次使用的是诺维赞的ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit连接酶，9个片段一次性连接成功。20uL的连接体系在37℃作用30 min，取10 uL用于转化。目的基因与载体的比例本次使用的载体是PcDNA3.1(5500bp)，基本50ng的载体就足够了。ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit试剂盒推荐的载体和片段的摩尔比为1：2，例如片段500bp，浓度5ng/uL，载体5000bp，浓度25ng/uL。则片段摩尔数是载体的2倍，片段需要2㗵=10ng，即2uL。转化取10 uL连接产物转化DH5a。阳性克隆的筛选在1.5mL的EP管中加入800 uL的氨苄LB，用10uL的枪头把单个菌落全部占走，打入EP管中，震荡培养4h。一般选择8个克隆。4h后进行菌液PCR鉴定阳性克隆，选择2个送测序。注意事项移码问题：选择酶切位点时注意是否会引起目的基因的移码，可用Snapgene模拟。感受态：购买的商品化感受态可一支当两用，否则太浓不好挑选。自制的感受态在使用前需设置阳性对照，排除感受态质量问题。终止密码子和起始密码子：用于蛋白表达的目的基因需从ATG开始，以终止密码子结尾。 𐟔砦ž„建小贴士退火温度优化：对于高保真酶，退火温度至关重要，可通过梯度PCR找到最佳温度。引物设计：选择合适的引物长度和位置，确保扩增效率和特异性。连接效率：优化连接体系，确保目的基因与载体的高效连接。筛选策略：通过多个克隆的筛选，提高阳性克隆的比例。通过以上步骤，你可以顺利构建出含有目的基因的载体，为后续实验打下坚实基础。

𐟌𑨽쥟𚥛 植物实验全攻略𐟧슰ŸŒŸ前期准备𐟌Ÿ 1️⃣ 构建表达载体： - 引物设计：利用PCR扩增基因全长或CDS。 - 质粒提取及重组：将空载体摇菌、酶切连接后转入大肠杆菌测序。 - 农杆菌转化：将测序正确的质粒转入农杆菌。 2️⃣ 建立再生体系： - 通过文献或正交试验，为外植体建立合适的再生体系。 𐟒娽쥟𚥛 操作𐟒劭取50ml农杆菌液，离心收集菌落。 - 用MS液等重悬液将菌体OD600稀释至0.5。 - 将外植体浸入重悬后的菌液5分钟。 - 将外植体转入培养皿，避光培养72小时。 - 72小时后，将外植体置于正常光照下，直至获得完整植株。 𐟔婘𓦀程—筛选与鉴定𐟔劭在抗性板上筛选阳性苗，或使用荧光观察法（如GFP或Cherry荧光基因）。 - 通过PCR和qRT-PCR对阳性苗进行鉴定。

植物遗传转化：从零开始到成功的指南 𐟌Ÿ 前期准备构建表达载体 𐟛 ️ 设计引物：根据需求设计引物，利用PCR扩增基因全长或CDS。质粒提取及同源重组：提取空载体质粒，进行酶切连接，然后转入大肠杆菌进行测序。农杆菌转化：将测序正确的菌液扩繁、保菌后提质粒，转入农杆菌。建立再生体系 𐟌𑊩€š过文献查阅或正交试验建立相应外植体的再生体系。如果不需要组织培养，此步可忽略。 𐟌Ÿ 转基因操作准备农杆菌液：取过夜摇好的农杆菌液50ml，室温5000rpm离心10min收集菌落。重悬菌体：加入重悬液（如MS液）将菌体OD600稀释至0.5，将外植体浸没于重悬后的菌液5min。培养外植体：将外植体转入培养皿中，用锡箔纸包好避光室温下培养72h。再生培养：72h后将外植体转入正常光照条件进一步进行再生培养，直至获得完整植株。 𐟌Ÿ 阳性苗的获得阳性苗筛选 𐟔 在抗性板上筛选阳性苗，如果有GFP或Cherry等荧光基因，可以使用荧光观察法。阳性苗鉴定 𐟔슥𐆩˜𓦀程—进行PCR鉴定和提取RNA反转录后进行qRT-PCR进行鉴定。

- 构建表达载体是分子生物学实验中的重要一步，以下是详细的步骤和注意事项：第一步：克隆目的基因 𐟧슩斥…ˆ，你需要克隆目的基因。虽然PCR反应看起来很简单，但很多人都会在这一步遇到问题。你的模板可能是质粒、cDNA或基因组DNA。PCR的结果取决于你使用的每个成分。首先，确保使用高保真酶，这样可以获得保真性强的基因。其次，引物设计要足够特异，长度可以稍长一些，建议一次设计多对引物，因为不一定一次就能成功。第二步：PCR体系与纯化 𐟧𜊥𛺨…ˆ用50的PCR体系，使用大孔胶跑条带并切胶回收。你的目的基因条带必须单一且长度正确，然后进行切胶纯化。不要嫌麻烦，因为这会影响后续连接到克隆载体的步骤。纯化后，别忘了测一下浓度，虽然浓度会比原先低，但问题不大。第三步：连接到克隆载体 𐟔— 将目的基因连接到克隆载体上是很重要的一步。每个实验室使用的克隆试剂盒可能不同，有的用T载，有的用B.zero。按照说明书操作即可。这一步必不可少，因为你的目的基因还没有经过测序，不能直接连接到表达载体上。克隆载体一般使用通用引物，操作方便。很多同学为了省事，直接将目的基因连接到表达载体上，这样后续可能会出现问题。第四步：转化大肠杆菌 𐟦 转化大肠杆菌是一个常规操作。市面上有很多品牌的大肠杆菌感受态细胞。使用时必须严格按照说明书操作，避免反复冻融。刚刚好融化时加入载体转化效率最高。第五步：筛选阳性克隆 𐟔 筛选阳性克隆是常规操作，具体步骤不再赘述。第六步：测序验证 𐟓Š 将提取的质粒进行PCR并送去测序，看看是否与你的目的基因相符。即使长度一致，也不一定是你想要的基因。第七步：连接到表达载体 𐟚€ 最后一步是将目的基因从克隆载体上PCR下来，连接到表达载体上。表达载体的种类很多，取决于你想转化的宿主细胞类型，有真核的、原核的、植物的、酵母的等。设计的引物和使用的连接方法有直接关系。最简便的方法是同源重组。如果使用同源重组方法，用同源臂引物PCR克隆载体。表达载体需要提前进行酶切线性化，推荐双酶切线性化，这样连接效率会更高。按照说明书操作即可，后续的转化大肠杆菌等步骤与之前相同。希望这些步骤能帮助你顺利构建表达载体！如果有任何问题，欢迎留言讨论，大家一起进步！

研0也能搞懂基因过表达！𐟎“ 基因过表达到底是个啥？简单来说，就是把你想研究的基因复制到一个载体上，然后设计出一些特殊的引物，把这个基因从原来的地方扩增出来。接着，通过一些方法，比如酶切或者gateway技术，把这个基因插入到一个表达载体中。最后，把这个表达载体转到目标细胞里，让细胞大量表达这个基因和它编码的蛋白质。这样一来，你就能研究这个基因过量表达后的效果了。基因过表达有两种常见的方法：稳定过表达（稳转）：这个方法是把表达载体整合到细胞的染色体上，让细胞长期表达这个基因。适用于研究基因的长期效应和遗传定性。不过，缺点也很明显，效率低，耗时时间长。瞬时过表达（瞬转）：这个方法是把质粒转入细胞质中，让细胞在短时间内表达这个基因。适用于研究基因的短期效应和功能分析。但它的缺点是持续时间短，无法进行遗传分析，还会受到剂量效应的影响。表达载体的几个重要部分：启动子：比如CMV、U6、SV40、EF1퉯𜌥𛬦Ž祈𖥟𚥛 转录，让目的基因在不同的细胞类型、组织或发育阶段中得以表达。标记基因：比如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因，这些基因能让细胞在特定条件下存活或死亡，用于筛选出成功转染的细胞。克隆位点：这是一种可以被特定酶切开的序列，用于插入目的基因。密码子：包括起始密码子和终止密码子，分别标志着蛋白质翻译的开始和结束。其他密码子是翻译编码氨基酸的，它们的顺序决定最终的表达蛋白。转染方法：物理方法：比如电穿孔、微注射、基因枪等，通过打破细胞膜让表达载体进入细胞。化学方法：利用化学物质包裹表达载体，形成复合物，通过与细胞膜结合或内吞作用进入细胞。常用的有钙磷共沉淀、脂质体介导法等。生物方法：利用生物载体携带表达载体，通过与细胞受体结合或感染作用进入细胞。比如病毒介导法、质粒介导法等。如果你还有什么疑问，欢迎在下面评论哦！𐟓쀀

同源重组构建质粒的详细步骤和注意事项 ❤️一、实验步骤 1️⃣ 载体线性化 ❶ 选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。推荐使用双酶切方法，以降低转化背景（假阳性克隆）。 ❷ 酶切时，注意酶切时间，确保载体完全线性化。若使用单酶切，可适当延长酶切时间。 2️⃣ PCR扩增插入片段 ❶ 设计带有同源臂的引物，引物5'端引入与线性化载体末端一致的同源序列（15-20 bp）。 ❷ 使用高保真聚合酶进行PCR扩增，确保扩增片段的准确性与特异性。 3️⃣ 重组反应 ❶ 将线性化载体与扩增的插入片段按一定比例混合，加入重组酶，在一定温度下反应一定时间（如37℃，30分钟）。 ❷ 重组反应完成后，可直接进行转化或储存于-20℃备用。 4️⃣ 转化与筛选 ❶ 将重组产物转化至感受态细胞（如DH5𜉯𜌧𛏨🇧ƒ�€、复苏和涂板等步骤，得到单克隆菌落。 ❷ 通过菌落PCR和质粒提取后的酶切鉴定，筛选阳性克隆。 5️⃣ 测序验证 ❶ 将疑似阳性克隆的菌液送测序公司进行双向测序，比对测序结果与设计序列是否一致。 ❷ 若测序结果正确，则表示重组质粒构建成功，可进行后续实验。 ❤️二、注意事项 1️⃣ 引物设计：同源臂的长度和GC含量需控制在合理范围内（15-20 bp，GC含量40%-60%），以提高重组效率。 2️⃣ 酶切与纯化：确保载体线性化完全，并进行彻底的纯化，避免环状质粒残留。 3️⃣ 重组比例：载体与插入片段的摩尔比通常为1:2，根据实际情况调整。 4️⃣ 转化条件：控制转化产物的量和感受态细胞的状态，以获得理想的转化效率。 ❤️三、原理概述同源重组法基于DNA分子间的同源序列，在重组酶的催化下实现载体与插入片段的定向重组。通过设计带有同源臂的引物，扩增出带有同源序列的插入片段，再与线性化的载体进行重组，最终得到重组质粒。 ❤️四、应用实例以RNase P表达载体的构建为例，通过NCBI查找基因序列，设计带有BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点的引物，扩增目的基因片段。随后，将目的基因片段与线性化的pGEX-2T载体进行同源重组，构建成功后转化至BL21工程菌中表达目的蛋白。

分子克隆实战指南：PCR篇 𐟔奈†子克隆的目的是构建目的基因重组体，并在细胞中验证其成功过表达。以下是主要流程： 1️⃣ PCR：获取目的基因TP53基因的CDS区（1182bp），通过PCR并经琼脂糖凝胶电泳验证条带，然后胶回收目的基因。 2️⃣ 酶切：将目的基因与载体用特定限制性核酸内切酶切割，暴露粘性末端，并分别胶回收这两部分。 3️⃣ 连接：用DNA连接酶连接暴露粘性末端的目的基因和载体。 4️⃣ 转化：将连接成功的环状产物转化到大肠杆菌感受态细胞。 5️⃣ 涂板：12-16小时后挑菌做菌落PCR验证。 6️⃣ 摇菌：直接摇菌中提（见之前菌落PCR笔记，可以省去小提步骤）。 7️⃣ 提取质粒并测序。 8️⃣ 转染：将质粒转染细胞24小时后（记得要有对照组，即只转染试剂组）。 9️⃣ 提取细胞总RNA。 𐟔Ÿ 逆转录成cDNA。 1️⃣1️⃣ 设计qPCR引物（Primer bank查询即可）。 1️⃣2️⃣ 实时荧光定量PCR检测目的基因TP53。 ⚠️注意事项： 1️⃣ PCR试剂盒选择：实验室之前使用Takara的Primer star高保真酶，后期发现很多国货非常好用，如ATG巨匠生物的ATG 2*Proofast Master Mix，PCR结果稳定，酶高保真且扩增效率高。 2️⃣ PCR程序设定的两个关键问题：退火温度：与引物性质有关，注意设计引物软件中的Tm值不应算上酶切位点和保护碱基，应只含互补配对部分，这时的退火温度才是准确的。理论上一定范围内，退火温度高时，特异性好。所以很多同学碰到有杂带的情况，可以适当提高退火温度；反之，如果条带不出，可以适当降低退火温度。延伸时间：延伸时间与片段长度有关，还与酶的延伸效率有关，可以参见DNA聚合酶的说明书。 3️⃣ 通过胶回收获得的产物是未暴露粘性末端的双链DNA，所以还需要后续的限制性核酸内切酶进行酶切，将载体和目的基因片段都暴露粘性末端，才能进一步连接。

拟南芥筛选你已经成功筛选出了T1代拟南芥，通过潮霉素筛选，DNA粗提后PCR检测显示96个样本基本全阳。你使用的是基因上游引物和载体通用下游引物。接下来，你可能会面临几个选择： 1️⃣ 基因表达水平验证：是否需要对每一代都进行qPCR或Western blot来验证基因表达或蛋白表达水平？还是说，等到拿到纯合的T3株系后再筛选高表达株系？ 2️⃣ 纯合株系筛选：你提到T1代收种子后铺板，选择阳性率3:1的株系继续种植。这是否意味着除了DNA粗筛，还需要额外数性状数量这一步？3:1的阳性苗种下去收T2代种子，铺板鉴定全阳，这个T2株系就是纯合株系，可以用来生长T3，进行表型实验。 3️⃣ 筛选策略：你提到只挑15-30个株系往下做应该够了吧？这是否意味着在每一代都进行基因表达或蛋白表达水平的验证？ 4️⃣ T2代纯合鉴定：T2代种子收获后，是否需要进行进一步的纯合鉴定？如何确保T2代种子是纯合的？ 5️⃣ 表型实验：一旦你有了纯合的T3株系，你将如何进行表型实验？这是否意味着你可以开始进行更深入的功能研究？以上是你可能需要考虑的几个关键点。希望这些信息能帮助你顺利进行拟南芥的纯合鉴定和功能研究。𐟌𑰟”쀀

逆转录RNA的那些事儿：小技巧大智慧 𐟌€ 提取RNA之后，咱们得想办法把它变成稳定的cDNA，这样才能方便后续的基因表达检测、表达载体构建以及测序啥的。RNA这东西太脆弱了，稍微不注意就搞砸了，所以逆转录这一步特别关键。逆转录产品大比拼市面上逆转录的产品主要有两类。一类是经典的ABI HC RT KIT，兼容性好，量大价廉，但缺点是反应时间有点长。另一类是以Superscribe为代表的快酶，虽然操作麻烦点，需要预先加热破坏RNA的二级结构，但时间短，效率高。我的选择：ABI RT KIT 今天我用的是ABI RT KIT。每个反应需要2ug的总RNA。因为我要做qPCR，所以选择了random hexamer作为引物。如果你需要构建表达载体，那就得用oligo dT；如果想检测特定基因的存在和表达量，可以用gene specific primer。操作步骤准备RT Master Mix： 10x RT Buffer：2ul Rnase Inhibitor：1ul Reverse Transcriptase：1ul Random hexamer：2ul dNTP：0.8ul Rnase free H2O：3.2ul 准备RNA样本：用Rnase free H2O补足到10ul 小贴士所有操作都要在冰上进行！联排PCR管不好用的话，可以用图3的那种heat block放在冰上，金属导热能力强，温度基本接近冰的温度。操作RNA的基本原则：开始前换手套、桌面、移液枪，手套用RNase eliminate reagent充分擦拭（如果找不到，可以用异丙醇或者高浓度的异硫氰酸胍/SDS溶液），注意避免接触皮肤、口鼻、眼睛！用barrier tip。反应时间： 25度 10分钟 37度 120分钟 85度 5分钟 4度保存逆转录后的cDNA非常稳定，室温、4度、负20度保存都可以。我亲自试过，室温放一年的cDNA和genomic DNA在PCR水平上没啥显著变化。总结逆转录虽然听起来简单，但细节决定成败。希望这些小技巧能帮到你，让你的实验更顺利！𐟚€