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同源重组引物设计网站下载_诺唯赞同源重组引物设计(2024年11月最新版)

内容来源：北京东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-11-28

同源重组引物设计网站

两款引物设计神器，轻松搞定！引物设计是分子生物学实验的关键步骤，选择合适的软件可以大大提高工作效率。以下是两款简单易用的引物设计软件，帮助你轻松搞定引物设计。 𐟔砓napGene SnapGene是一款功能强大的引物设计软件，特别适合初学者。它支持同源重组引物设计，步骤如下：载体线化：通过酶切或反向PCR方法将载体线性化。同源臂碱基：根据酶切位点选择合适的同源臂长度，注意顶部链直接复制，底部链选择5端到3端的序列。复制顶部链碱基：直接复制顶部链的碱基序列。复制底部链碱基：复制底部链的碱基序列。复制氨基酸：根据需要复制相应的氨基酸序列。复制图谱：生成引物设计的图谱。 𐟌 NCBI NCBI是另一款广受欢迎的引物设计软件，操作简单，功能全面。你可以根据自己的需求选择合适的引物设计方法，轻松完成引物设计。这两款软件各有特色，大家可以根据自己的喜好和需求选择学习。当然，如果你想要更全面的功能，不妨两款都试试，毕竟小孩子才做选择，大人当然是全都要！𐟘‰

构质粒90%成功的秘诀：超长引物的使用 𐟧젥ˆ学者都知道，引物设计有一条基本原则：引物长度不超过30bp，与目的基因互补序列15-20bp，以及3'端不能是GC等。但在实际操作中，我发现其实不需要严格遵守这些原则。现在的PCR酶效率非常高，退火温度用到70度完全没问题。 𐟧젦ˆ‘这里说的超长引物是指50-60bp，与目的片段互补序列或同源臂在30bp左右，退火温度直接用70度。这样的引物特异性非常好，与目的片段结合的效率很高，不容易形成引物二聚体，PCR几乎都能一次性成功。同源臂长重组效率也高，平板上长出来的菌大部分都是重组成功的，大大缩短筛选的时间。 𐟧젩‚㤹ˆ什么时候需要超长引物呢？ 1️⃣ 模板质量：如果模板是质粒，那么目的基因的浓度和纯度都非常好，互补序列在15-20bp之间都可以P出来（但依然有失败的概率，所以为了节省时间我都用长引物）。如果模板是cDNA，那么里面东西比较杂，浓度可能也不高，所以需要提高引物特异性，让它更容易捕捉到你的目的基因。 2️⃣ 引物容易形成二聚体：正反引物有不可避开的6-10bp的互补序列，可以通过延长引物的总长度，提高与目的基因结合的效率，避免引物二聚。 3️⃣ 同源重组失败：需要延长同源臂。 𐟧젥…𓤺Ž构质粒之前已经发过好几篇笔记，大家可以翻看。最近又收获了一些心得，我会进一步综合整理出来一个系列，希望对大家有帮助～

植物遗传转化：从零开始到成功的指南 𐟌Ÿ 前期准备构建表达载体 𐟛 ️ 设计引物：根据需求设计引物，利用PCR扩增基因全长或CDS。质粒提取及同源重组：提取空载体质粒，进行酶切连接，然后转入大肠杆菌进行测序。农杆菌转化：将测序正确的菌液扩繁、保菌后提质粒，转入农杆菌。建立再生体系 𐟌𑊩€š过文献查阅或正交试验建立相应外植体的再生体系。如果不需要组织培养，此步可忽略。 𐟌Ÿ 转基因操作准备农杆菌液：取过夜摇好的农杆菌液50ml，室温5000rpm离心10min收集菌落。重悬菌体：加入重悬液（如MS液）将菌体OD600稀释至0.5，将外植体浸没于重悬后的菌液5min。培养外植体：将外植体转入培养皿中，用锡箔纸包好避光室温下培养72h。再生培养：72h后将外植体转入正常光照条件进一步进行再生培养，直至获得完整植株。 𐟌Ÿ 阳性苗的获得阳性苗筛选 𐟔 在抗性板上筛选阳性苗，如果有GFP或Cherry等荧光基因，可以使用荧光观察法。阳性苗鉴定 𐟔슥𐆩˜𓦀程—进行PCR鉴定和提取RNA反转录后进行qRT-PCR进行鉴定。

- 构建表达载体是分子生物学实验中的重要一步，以下是详细的步骤和注意事项：第一步：克隆目的基因 𐟧슩斥…ˆ，你需要克隆目的基因。虽然PCR反应看起来很简单，但很多人都会在这一步遇到问题。你的模板可能是质粒、cDNA或基因组DNA。PCR的结果取决于你使用的每个成分。首先，确保使用高保真酶，这样可以获得保真性强的基因。其次，引物设计要足够特异，长度可以稍长一些，建议一次设计多对引物，因为不一定一次就能成功。第二步：PCR体系与纯化 𐟧𜊥𛺨…ˆ用50的PCR体系，使用大孔胶跑条带并切胶回收。你的目的基因条带必须单一且长度正确，然后进行切胶纯化。不要嫌麻烦，因为这会影响后续连接到克隆载体的步骤。纯化后，别忘了测一下浓度，虽然浓度会比原先低，但问题不大。第三步：连接到克隆载体 𐟔— 将目的基因连接到克隆载体上是很重要的一步。每个实验室使用的克隆试剂盒可能不同，有的用T载，有的用B.zero。按照说明书操作即可。这一步必不可少，因为你的目的基因还没有经过测序，不能直接连接到表达载体上。克隆载体一般使用通用引物，操作方便。很多同学为了省事，直接将目的基因连接到表达载体上，这样后续可能会出现问题。第四步：转化大肠杆菌 𐟦 转化大肠杆菌是一个常规操作。市面上有很多品牌的大肠杆菌感受态细胞。使用时必须严格按照说明书操作，避免反复冻融。刚刚好融化时加入载体转化效率最高。第五步：筛选阳性克隆 𐟔 筛选阳性克隆是常规操作，具体步骤不再赘述。第六步：测序验证 𐟓Š 将提取的质粒进行PCR并送去测序，看看是否与你的目的基因相符。即使长度一致，也不一定是你想要的基因。第七步：连接到表达载体 𐟚€ 最后一步是将目的基因从克隆载体上PCR下来，连接到表达载体上。表达载体的种类很多，取决于你想转化的宿主细胞类型，有真核的、原核的、植物的、酵母的等。设计的引物和使用的连接方法有直接关系。最简便的方法是同源重组。如果使用同源重组方法，用同源臂引物PCR克隆载体。表达载体需要提前进行酶切线性化，推荐双酶切线性化，这样连接效率会更高。按照说明书操作即可，后续的转化大肠杆菌等步骤与之前相同。希望这些步骤能帮助你顺利构建表达载体！如果有任何问题，欢迎留言讨论，大家一起进步！

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