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克隆引物设计在线网站下载_ncbi网站(2024年12月最新版)

内容来源：北京东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-12-02

克隆引物设计在线网站

同源重组构建质粒的详细步骤和注意事项 ❤️一、实验步骤 1️⃣ 载体线性化 ❶ 选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。推荐使用双酶切方法，以降低转化背景（假阳性克隆）。 ❷ 酶切时，注意酶切时间，确保载体完全线性化。若使用单酶切，可适当延长酶切时间。 2️⃣ PCR扩增插入片段 ❶ 设计带有同源臂的引物，引物5'端引入与线性化载体末端一致的同源序列（15-20 bp）。 ❷ 使用高保真聚合酶进行PCR扩增，确保扩增片段的准确性与特异性。 3️⃣ 重组反应 ❶ 将线性化载体与扩增的插入片段按一定比例混合，加入重组酶，在一定温度下反应一定时间（如37℃，30分钟）。 ❷ 重组反应完成后，可直接进行转化或储存于-20℃备用。 4️⃣ 转化与筛选 ❶ 将重组产物转化至感受态细胞（如DH5𜉯𜌧𛏨🇧ƒ�€、复苏和涂板等步骤，得到单克隆菌落。 ❷ 通过菌落PCR和质粒提取后的酶切鉴定，筛选阳性克隆。 5️⃣ 测序验证 ❶ 将疑似阳性克隆的菌液送测序公司进行双向测序，比对测序结果与设计序列是否一致。 ❷ 若测序结果正确，则表示重组质粒构建成功，可进行后续实验。 ❤️二、注意事项 1️⃣ 引物设计：同源臂的长度和GC含量需控制在合理范围内（15-20 bp，GC含量40%-60%），以提高重组效率。 2️⃣ 酶切与纯化：确保载体线性化完全，并进行彻底的纯化，避免环状质粒残留。 3️⃣ 重组比例：载体与插入片段的摩尔比通常为1:2，根据实际情况调整。 4️⃣ 转化条件：控制转化产物的量和感受态细胞的状态，以获得理想的转化效率。 ❤️三、原理概述同源重组法基于DNA分子间的同源序列，在重组酶的催化下实现载体与插入片段的定向重组。通过设计带有同源臂的引物，扩增出带有同源序列的插入片段，再与线性化的载体进行重组，最终得到重组质粒。 ❤️四、应用实例以RNase P表达载体的构建为例，通过NCBI查找基因序列，设计带有BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点的引物，扩增目的基因片段。随后，将目的基因片段与线性化的pGEX-2T载体进行同源重组，构建成功后转化至BL21工程菌中表达目的蛋白。

𐟧쐃R与RT-PCR的探秘之旅𐟔 𐟔쥜觔Ÿ物技术的广阔天地里，PCR与RT-PCR都是不可或缺的工具。最近，我深入探索了这两种技术，尤其是RT-PCR，它究竟有何魅力呢？ 𐟒ᩦ–先，RT-PCR与PCR的融合，使得在单个EP管中就能完成逆转录和聚合酶链式反应，这无疑大大简化了操作步骤。然而，这一步也带来了不小的挑战。每次转录一个RNA分子就需要消耗一个逆转录酶，这无疑增加了实验的成本和复杂性。 𐟓š在NCBI的网站上，我找到了许多关于RT-PCR的详细资料。虽然我在理解引物设计方面还有一些疑惑，比如如何选择合适的exon-exon进行设计，以及克隆时如何间接设计引物等。但我相信，随着不断的探索和学习，这些难题都将迎刃而解。 𐟒ꦀ𛧚„来说，RT-PCR以其独特的优势在生物技术领域占据了一席之地。虽然它的一些缺点也让实验者头疼不已，但正是这些挑战激发了我们的探索欲望。 𐟔–PS：在学习之余，也别忘了欣赏一下美丽的风景，比如《铃芽之旅》中的美景，它们也能给我们的心灵带来愉悦和放松哦！

SnapGene：科研全能助手亲爱的科研伙伴们，今天我要向大家介绍一款让我在科研道路上大放异彩的软件——SnapGene。 𐟔죀专业级工具】 SnapGene是一款专为生物科学研究设计的软件，它涵盖了从简单的DNA序列编辑到复杂的基因克隆操作。无论是基因合成、引物设计还是酶切位点分析，SnapGene都能轻松搞定。 𐟓ˆ【高效可视化】这款软件的可视化功能非常强大，可以直观地查看和编辑DNA序列，让复杂的生物学问题变得简单易懂。这对于我们理解基因结构和功能至关重要。 𐟔—【无缝集成】 SnapGene能够与其他生物信息学软件无缝集成，这意味着我们可以在一个统一的平台上完成从序列设计到实验结果分析的全部工作。 𐟓š【丰富的学习资源】对于新手来说，SnapGene提供了详尽的教程和文档，帮助用户快速掌握软件的使用技巧。而且，它的用户社区也非常活跃，可以找到很多实用的建议和解决方案。 𐟒𛣀跨平台支持】无论你使用的是Windows、Mac还是Linux系统，SnapGene都能提供一致的用户体验，让我们可以在任何设备上进行科研工作。 𐟚€【加速科研进程】使用SnapGene，实验设计和数据分析效率都会有显著提升，可节省了大量时间，让你更专注于科研创新。

载体构建攻略𐟔犰Ÿ”젨𝽤𝓦ž„建全流程目的基因的扩增首先，从NCBI上找到目的基因的核苷酸序列，利用Snapgene设计引物。通常在序列的前后各选20-25bp作为上下游引物。先用普通MIX进行退火温度优化，然后使用高保真酶（如诺维赞的2X Phanta⮠Max Master Mix）进行50uL体系的扩增。若需要高浓度，可扩增两管。连接连接目的基因与载体可选择T4连接酶，需在目的基因两端设计酶切位点和保护碱基（注意这些位点不能出现在片段内，以免片段被内部切开）。也可选择无缝克隆方式，利用同源重组原理，在引物5'端加入载体的同源臂，引物顺序为同源臂+酶切位点+基因引物。我个人偏爱这种方式，省时方便。本次使用的是诺维赞的ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit连接酶，9个片段一次性连接成功。20uL的连接体系在37℃作用30 min，取10 uL用于转化。目的基因与载体的比例本次使用的载体是PcDNA3.1(5500bp)，基本50ng的载体就足够了。ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit试剂盒推荐的载体和片段的摩尔比为1：2，例如片段500bp，浓度5ng/uL，载体5000bp，浓度25ng/uL。则片段摩尔数是载体的2倍，片段需要2㗵=10ng，即2uL。转化取10 uL连接产物转化DH5a。阳性克隆的筛选在1.5mL的EP管中加入800 uL的氨苄LB，用10uL的枪头把单个菌落全部占走，打入EP管中，震荡培养4h。一般选择8个克隆。4h后进行菌液PCR鉴定阳性克隆，选择2个送测序。注意事项移码问题：选择酶切位点时注意是否会引起目的基因的移码，可用Snapgene模拟。感受态：购买的商品化感受态可一支当两用，否则太浓不好挑选。自制的感受态在使用前需设置阳性对照，排除感受态质量问题。终止密码子和起始密码子：用于蛋白表达的目的基因需从ATG开始，以终止密码子结尾。 𐟔砦ž„建小贴士退火温度优化：对于高保真酶，退火温度至关重要，可通过梯度PCR找到最佳温度。引物设计：选择合适的引物长度和位置，确保扩增效率和特异性。连接效率：优化连接体系，确保目的基因与载体的高效连接。筛选策略：通过多个克隆的筛选，提高阳性克隆的比例。通过以上步骤，你可以顺利构建出含有目的基因的载体，为后续实验打下坚实基础。

PCR实验全攻略：从引物设计到结果分析大家好！今天我们来聊聊分子克隆中的PCR实验。上一期我们已经介绍了引物设计的基础知识，这一期我们就来聊聊PCR的具体操作步骤。 PCR反应体系：你需要准备什么？𐟧ꊊ首先，PCR反应体系需要哪些东西呢？每个实验室用的酶可能都不一样，所以最好还是看看你实验室用的酶的说明书。以下是一个常见的2㗐hanta Flash Master Mix酶的加样体系：先加水：提前计算好每个样品的加水量，然后从大体积开始加，这样更准确。加酶：根据说明书上的推荐量加入。加引物：根据引物的浓度来决定。加模板：如果是基因组或菌体，变性时间3分钟；如果是质粒或片段，变性时间30秒。 PCR反应程序设置：如何设置？𐟓Š PCR反应程序的设置也是关键。以下是一个常见的2㗐hanta Flash Master Mix酶的反应程序：变性（Denaturation）在95Ⰳ下变性30秒，让DNA双链解链成单链。这个步骤不需要修改，但变性时间可以根据模板的不同进行调整。退火（Annealing）在55Ⰳ下退火30秒，让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。退火温度可以根据引物的设计进行调整。延伸（Extension）在72Ⰳ下延伸1分钟，聚合酶开始合成新的DNA链。这个步骤一般不需要修改。循环数设置根据需要回收的片段大小，一般30个循环左右就够了。如果不需要回收，可以设置35个循环。其他步骤除了基本的PCR步骤，PCR仪还可以进行一些固定温度的孵育，比如37Ⰳ恒温酶切等操作。小贴士𐟓 枪头只沾到一点点液体也没关系，一般都能成功PCR。但还是要确认枪头有没有吸到相应的小体积液体。不同的酶延伸速度和温度可能不一样，需要根据具体情况调整。希望这些信息对你有所帮助！如果你有任何问题或需要进一步的指导，欢迎随时留言讨论哦！

分子克隆实验指南：从零开始到成功大家好！首先，非常感谢你们的关注和喜欢，真的很开心我的笔记能帮到大家。还记得最开始的那篇笔记，记录了我那次离谱的分子克隆实验，4个片段的同源重组竟然花了两个月！后来我慢慢发现，分子克隆其实非常微妙，有点像高中时的数学，学霸们轻而易举考100分，而我这种小学渣每次都在及格边缘反复横踩。所以，我想用这个账号记录我的科研日常，希望能和大家一起学习。之前的几篇笔记中，我分享过引物设计、载体酶切、同源重组等非常具体的实验方法。但最近我发现，很多粉丝朋友们刚开启自己的科研之旅，或者是偏向临床的科研大佬们，对分子克隆实验整体了解比较少。所以今天，我想跟大家分享一下质粒构建的大体流程。明确你的目标 𐟎斥…ˆ，在构建质粒之前，你需要有一个清晰的计划。明确你要使用哪种克隆方法，比如同源重组、TOPO克隆还是T4连接。TOPO/TA克隆不需要同源臂，而同源重组和T4连接是需要同源臂的。选择合适的载体 𐟚€ 根据你的实验目的，选择合适的表达载体。例如，常用的原核表达载体有pET28a，真核表达载体有pcDNA3.1，CRISPR/Cas9表达载体有Lenti-V2等等。载体可以通过酶切或者环形PCR后，跑胶回收所需的载体片段。设计引物并扩增片段 𐟔슦 𙦍€选的构建方法，设计并合成引物。PCR扩增需要插入的目的片段，PCR的产物也需要通过跑胶回收。连接与转化 𐟔„ 将载体和目的片段连接后，转入合适的感受态细胞内。例如，DH5˜“产生突变或者缺失，而Stable3相对更加稳定。但提质粒时需要使用试剂盒中的去蛋白液洗3遍，以充分去除核酸酶，减少后续对质粒酶切等实验的影响。通常连接产物的用量不超过总体积的1/20。然后在冰上静止20分钟，热激1分钟，再冰上静置3分钟，加入无抗的LB培养基，摇床摇40-60分钟，最后涂在合适抗性的LB平板上。培养与鉴定 𐟧ꊌB板子放在37度培养箱内过夜生长，第二天挑取单克隆细胞，置于合适抗性的LB培养基中摇菌，然后提质粒送测序公司测序。如果你想偷懒的话，也可以直接送菌液到公司哦，菌液和质粒的测序价格是一样的。今天就分享到这啦，希望这些内容对大家有用！如果有什么问题或者要补充的，欢迎评论或者私信哦！𐟘Š

三分钟搞懂T4法构建载体的三种变式连接今天我们来聊聊T4法在构建载体时的三种变式连接。T4法常用于空载体的改造，通过两种内切酶将质粒DNA切开，产生带有黏性末端的线性化载体。目的片段通常是合成的小片段DNA分子，长度通常在100bp以下。首先，我们来说说环PCR。环PCR的点突变一般只能引入60bp以下的序列。具体来说，60bp中，20bp作为扩增序列，40bp是额外添加的5’端附加序列，其中需要包含一段同源臂，真正能引入的大概只有40-45bp的额外序列。很少看到有人把PCR使用的引物设计到60bp以上。接下来是无缝克隆。无缝克隆在载体骨架上引入100bp左右的小片段更是一种灾难。无缝克隆酶主要包含三种核心功能酶：5’端核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。其中5’端核酸外切酶的功能远比大家想象的更加强大。虽然我们讲同源臂加20bp左右的序列，但其实5’端核酸外切酶远不止切割掉这20bp左右的同源臂，个人认为切割长度起码在60bp以上。左右各切60bp的话，我们合成的100bp的DNA分子其实已经被切碎了，自然不可能连接到载体上。所以，我们只能通过T4法将80-150bp的短小DNA序列插入载体骨架。具体设计方式如上图所示。下一期，我们将探讨一种被称为“玄学”的技术——搭桥PCR或重叠PCR。这是我以前做分子克隆时第一个感觉玄学的实验，当然到现在我自认为已经非常精通其原理，但仍感觉其相当玄学。关注我，我们一起领略科研背后的底层逻辑！

目的基因克隆的三大法宝：PCR技巧详解在分子生物学研究中，目的基因的克隆是实验成功的关键。𐟔 然而，目的基因的扩增常常是一个挑战，尤其是当需要在UTR区设计引物时，因为这些区域可能包含大量的重复序列，使得PCR扩增变得困难重重。𐟌€ 𐟌ˆ 降落PCR：精准调试的艺术降落PCR是一种巧妙的PCR技术，它允许在PCR扩增过程中逐步降低退火温度，从而在多个温度点尝试引物与模板DNA的结合。这种方法可以制造出初步的PCR产物，然后在固定的退火温度下进行第二轮扩增，从而提高扩增成功率。𐟔劊𐟔’ 巢式PCR：特异性扩增的保证巢式PCR以其高特异性著称。它需要在UTR区设计两对引物，首先进行第一轮扩增获得PCR产物，然后将其稀释后进行第二轮扩增。这种方法的关键在于第一轮产物的稀释，即使琼脂糖胶上看不到条带，也可能存在微量的PCR产物，因此大胆进行第二轮PCR扩增是成功的关键。𐟔— 𐟛 ️ 半巢式PCR：灵活性与效率的结合半巢式PCR结合了巢式PCR和降落PCR的优点，它允许在UTR区设计第一对引物进行初步扩增，然后在CDS区选定引物进行第二轮扩增。这种方法不仅提供了更大的引物设计空间，还能对长片段进行拆分扩增，最终通过多片段重组将目的基因连接到载体上。𐟌 通过以上三种PCR方法，我们可以更有效地克隆目的基因。𐟎‰ 在实际操作中，选择合适的方法至关重要，因为不同的基因和实验条件可能需要不同的策略。记住，没有克隆不出来的基因，只有不合适的方法。𐟌Ÿ

RNA扩增失败？六大原因揭秘！在进行RNA的PCR扩增时，如果操作无误，但扩增不成功，可能是以下原因导致的： 𐟔 细胞类型选择不当：如果选择的细胞不表达目的基因或表达量很低，扩增自然不成功。此时，需要检查目的基因在哪些细胞中表达，挑选表达量较高的细胞，重新提取RNA并进行反转录和PCR扩增。 𐟒Š 诱导表达不足：如果目的基因在天然状态下表达量很低，但可以在某些信号刺激下诱导表达，可以先用刺激物处理细胞，诱导目的基因大量表达，再提取RNA并进行反转录和PCR扩增。例如，干扰素刺激基因在Poly(I:C)刺激后容易扩增。 𐟔„ RNA提取问题：如果RNA提取步骤不当，导致RNA质量或浓度不高，可以优化提取步骤，提高RNA质量或浓度，增加模板量进行PCR扩增。 𐟔„ 长片段PCR：如果目的基因太长，可以将目的基因分成两段进行PCR，然后通过overlap将两个片段连接起来。 𐟔 引物设计问题：有时目的基因在N端或C端的G/C含量异常，导致没有合适的引物。可以先从其他位置设计引物将目的基因扩增出来，再设计新的引物将G/C含量异常的片段放到引物末端突出位置，以第一轮PCR的产物为模板进行第二轮PCR。 𐟔 引物不特异：设计的引物不特异，可以回收目的基因大小的片段，或在平板上多挑几个克隆测序，其中可能有需要的基因（当然也会混杂其他不需要的基因）。 𐟔„ PCR片段短于预期：如果引物特异，PCR条带很亮但短于预期，可能是扩增了不同的转录本（isoform）。如果测序发现短的不多，可以将缺失的片段设计到引物上，通过PCR将缺失的片段插入全长。如果重复多次都是缺失较长的片段，可以换不同的细胞系提RNA反转录后再PCR。 𐟔„ 长基因扩增困难：一般大于3000 bp的基因从细胞里扩增较难，短于1500 bp的通常都很好扩增。希望这些信息能帮助你解决PCR扩增不成功的问题！

- 构建表达载体是分子生物学实验中的重要一步，以下是详细的步骤和注意事项：第一步：克隆目的基因 𐟧슩斥…ˆ，你需要克隆目的基因。虽然PCR反应看起来很简单，但很多人都会在这一步遇到问题。你的模板可能是质粒、cDNA或基因组DNA。PCR的结果取决于你使用的每个成分。首先，确保使用高保真酶，这样可以获得保真性强的基因。其次，引物设计要足够特异，长度可以稍长一些，建议一次设计多对引物，因为不一定一次就能成功。第二步：PCR体系与纯化 𐟧𜊥𛺨…ˆ用50的PCR体系，使用大孔胶跑条带并切胶回收。你的目的基因条带必须单一且长度正确，然后进行切胶纯化。不要嫌麻烦，因为这会影响后续连接到克隆载体的步骤。纯化后，别忘了测一下浓度，虽然浓度会比原先低，但问题不大。第三步：连接到克隆载体 𐟔— 将目的基因连接到克隆载体上是很重要的一步。每个实验室使用的克隆试剂盒可能不同，有的用T载，有的用B.zero。按照说明书操作即可。这一步必不可少，因为你的目的基因还没有经过测序，不能直接连接到表达载体上。克隆载体一般使用通用引物，操作方便。很多同学为了省事，直接将目的基因连接到表达载体上，这样后续可能会出现问题。第四步：转化大肠杆菌 𐟦 转化大肠杆菌是一个常规操作。市面上有很多品牌的大肠杆菌感受态细胞。使用时必须严格按照说明书操作，避免反复冻融。刚刚好融化时加入载体转化效率最高。第五步：筛选阳性克隆 𐟔 筛选阳性克隆是常规操作，具体步骤不再赘述。第六步：测序验证 𐟓Š 将提取的质粒进行PCR并送去测序，看看是否与你的目的基因相符。即使长度一致，也不一定是你想要的基因。第七步：连接到表达载体 𐟚€ 最后一步是将目的基因从克隆载体上PCR下来，连接到表达载体上。表达载体的种类很多，取决于你想转化的宿主细胞类型，有真核的、原核的、植物的、酵母的等。设计的引物和使用的连接方法有直接关系。最简便的方法是同源重组。如果使用同源重组方法，用同源臂引物PCR克隆载体。表达载体需要提前进行酶切线性化，推荐双酶切线性化，这样连接效率会更高。按照说明书操作即可，后续的转化大肠杆菌等步骤与之前相同。希望这些步骤能帮助你顺利构建表达载体！如果有任何问题，欢迎留言讨论，大家一起进步！

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