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设计sirna的网站下载_sirna设计时目标序列的选择原则(2024年12月最新版)

内容来源：北京东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-11-30

设计sirna的网站

直播预告｜解码siRNA：药物设计优化策略与体外药效评价精讲

揭秘DDX1与ATM，探索A-T奥秘 𐟔 实验目的：本实验旨在探究DDX1是否在ATM的调控下参与A-T患者成纤维细胞对氧化应激的响应。 𐟓Š 实验设计思路： 2.1 比较研究：通过比较A-T患者成纤维细胞（ATM基因突变）和正常成纤维细胞在氧化应激条件下的表现，来评估ATM和DDX1的功能。 2.2 功能丧失研究：通过敲低（siRNA技术）DDX1和ATM，研究它们在氧化应激中的单独和联合作用。 𐟏�ꌦ�ꤥ’Œ方法： 3.1 细胞培养和氧化应激诱导：细胞模型：使用A-T患者成纤维细胞（AT2BE和AT3BI）和正常成纤维细胞（GM38和GM10）。氧化应激诱导：使用钠砷酸盐（arsenite）处理细胞，模拟氧化应激条件。 3.2 DDX1和ATM的敲低：使用siRNA技术敲低DDX1和ATM，以研究它们在氧化应激中的作用。 3.3 ROS水平测量： ROS测量：使用H2DCF-DA和MitoSOX-Red荧光探针来定量细胞内ROS水平，评估氧化应激的程度。 3.4 RNA免疫沉淀（RIP）： RIP实验：利用抗DDX1抗体进行RNA免疫沉淀，以捕获与DDX1结合的RNA。 qRT-PCR分析：对沉淀的RNA进行qRT-PCR分析，以确定DDX1靶标RNA。 3.5 细胞存活和死亡分析： TUNEL实验：检测细胞凋亡。克隆形成实验：评估细胞在氧化应激后的长期存活能力。 3.6 细胞分离和RNA及蛋白水平测量：细胞分离：分离细胞质和核提取物，以测量特定RNA和蛋白的水平。 3.7 统计分析：使用Student’s t-test进行数据分析，以确定实验结果的统计显著性。 𐟓ˆ 实验结果预期： DDX1和ATM的功能：预期在ATM缺失的细胞中，DDX1对其靶标RNA的保护作用会减弱，导致细胞在氧化应激下的存活能力下降。氧化应激响应：预期在ATM和DDX1敲低的细胞中，ROS水平会升高，细胞死亡会增加。 𐟎ꌦ„义：通过这些实验，研究者能够揭示ATM和DDX1在A-T患者细胞中对抗氧化应激的复杂作用，以及这种作用如何影响细胞的生存和功能。这个实验设计通过多角度、多步骤的方法，全面评估了ATM和DDX1在氧化应激中的作用，为理解A-T的病理机制提供了重要的实验数据。

siRNA 转染效率不理想，背后原因是什么？

一分钟搞懂基因过表达、敲低、敲除的区别嘿，大家好！今天咱们来聊聊基因操作里的三个常见术语：过表达、敲低和敲除。别担心，只需要一分钟，你就能搞懂它们的区别啦！基因过表达 𐟚€ 基因过表达，简单来说，就是把一个基因插到一个表达载体里，然后把这个载体转染到目标细胞里。这样一来，细胞就会大量表达这个基因和它编码的蛋白质。常见的载体有哺乳动物载体（用于人、小鼠等哺乳动物细胞）、原核载体（用于大肠杆菌等原核生物）和慢病毒载体（比如HIV、FIV、SIV、EIA）。构建这些载体的方法包括设计目的基因片段和载体、连接元件（用酶切或gateway连接），然后通过病毒载体、电穿孔或转染试剂导入目标细胞。基因敲低 𐟛‘ 基因敲低呢，主要是用抑制剂来抑制基因的表达。常见的方法有RNA干扰技术（RNAi）、CRISPR-Cas9技术和gene转染技术。比如，siRNA载体通过与目标mRNA互补结合序列，特异性地实现靶向mRNA降解。而CRISPR载体则包含CRISPR靶向序列和转录抑制子。构建这些载体的步骤包括设计干扰序列、合成和克隆、转化和筛选，最后通过病毒等途径导入目标细胞。基因敲除 ✂️ 基因敲除则是用含有已知序列的小DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合到受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。常见的载体有CRISPR/Cas9载体和TALENs载体。CRISPR/Cas9载体通过Cas9核酸酶和sgRNA靶向序列精确定位并靶向基因DNA序列，然后引入双链断裂点，完成基因敲除。而TALENs载体则包含特异性核酸酶和nuclease binding domain，通过切割靶向基因DNA序列，完成敲除和编辑。构建这些载体的方法包括设计和选择靶点、载体插入、转化和验证，最后通过病毒载体、电穿孔等方法导入目标细胞。总结 𐟓 总的来说，基因过表达、敲低和敲除这三种技术在生物学研究中有着广泛的应用。了解它们的原理和构建方法，可以帮助你更好地设计和执行实验。希望这篇文章能让你在短时间内对它们有个清晰的认识！如果你有任何问题或需要进一步的解释，欢迎在评论区留言哦！𐟘Š

国自然研究方案关键技术全解析 𐟍š 米饭再美味，没有米也是白搭。同样，科研工作再精彩，没有合适的实验技术也是枉然。 𐟔 在撰写研究方案时，深入理解并掌握关键实验技术至关重要。这不仅能帮助你更好地把控研究方案，还能提升你的设计能力，让你在科研的舞台上游刃有余。 𐟌쯸 例如，你知道WB（Western Blot）实验的真正目的吗？它不仅仅是检测蛋白表达水平，还能定量计算蛋白丰度。那么，为什么还需要ELISA技术呢？因为它们各有千秋，相互补充。 𐟔砦Š€术之间是相互依赖的，没有一种技术可以完全替代另一种。因此，理解这些技术的原理、特点和实验目的，以及可能的实验结论，是创新和优化研究方案的关键。 𐟓 以下是国自然研究方案中常见的一些关键实验技术总结：检测RNA分子的空间分布和表达丰度：活细胞动态RNA成像技术、单分子RNA FISH原位杂交、多分子RNA Scope原位杂交技术、细胞核-细胞质分离结合qPCR、单细胞测序技术、空间转录组技术、Northern blot、dot blot等。检测蛋白分子的空间分布和表达丰度：免疫荧光、免疫组化、细胞核-细胞质分离结合WB、GFP标签融合蛋白示踪技术、空间蛋白质组学等。检测DNA拷贝数和突变：FISH原位杂交、qPCR、基因组测序等。检测蛋白分子总的表达量（不含空间信息）：ELISA技术（定量）、Western Blot技术（半定量，不准确）。检测蛋白分子的分子量大小（不含空间信息）：分子筛层析法、Western Blot技术、双向2D电泳、质谱分析等。检测蛋白分子的高级结构信息：蛋白结晶后冷冻电镜解析高级结构、分子对接分析等。分子表达干预技术：分子克隆操纵表达技术、病毒载体过表达或者敲减表达（shRNA、siRNA）、点突变技术、CRISPR敲除或者敲入技术、CRISPRi沉默技术、功能区分段（truncate）敲除技术、靶蛋白小分子抑制剂或者单抗抑制剂等。体内水平探索分子功能：类器官、PDX模型、裸鼠皮下成瘤、各种疾病动物模型、活体成像技术等。细胞功能探索：细胞增殖、细胞周期检测、细胞衰老、细胞干性、细胞分化、细胞凋亡、细胞焦亡、炎症风暴、迁移、侵袭能力，表面受体表达等。 𐟚€ 在选择关键技术时，务必量力而行，确保符合你所在实验室的硬件设施和技术水平。避免为了追求新颖而脱离实际，评审专家会对此提出质疑。 𐟌Ÿ 掌握这些关键技术，你的研究方案将更加全面和深入，为科研工作的成功打下坚实基础。

siRNA转染实验步骤及要点详解 siRNA转染步骤：以EpFed转染试剂转染siRNA/质粒于24孔板，siRNA浓度为50nM为例。 1）储存液准备：siRNA使用前瞬时离心，用RNase-free H2O或灭菌ddH2O配制成20/L储存液，分装保存，避免反复冻融（建议不超过5次）。 2）细胞接种：贴壁细胞：转染前24小时接种0.5 - 2㗱05个细胞，转染时细胞融合度为30 - 50%。（铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长）悬浮细胞：转染前24小时接种0.5 - 2㗱05个细胞，转染时细胞数量应在4 - 8㗱05/孔。 3）转染步骤： A. 用25 ⵌ Opti-MEM（或不含抗生素和血清的DMEM培养基）稀释1.25⵬ siRNA（20/L储存液）/500ng质粒，并用枪轻轻吹打3 - 5 次混匀，再加入1.0 ⵌEpFed转染试剂，用枪轻轻吹打3 - 5 次混匀，不可Vortex或离心。siRNA转染细胞的终浓度为50 nM，室温孵育20分钟。 B. 按照24孔板每孔25ⵌ转染试剂-siRNA/质粒混合物，均匀加入到24孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。 C. 细胞板置于37℃、5% CO2培养箱中培养48-72小时。对于某些细胞对EpFed转染试剂比较敏感，可以在转染后4-6小时更换细胞培养液，转染效率无显著影响。 4）效果检测：转染完成后48-72小时均可进行沉默/过表达效果检测，最佳检测时间与细胞类型、转染试剂、检测目的等相关。 siRNA基因沉默效率的常见测定方法和注意事项： QPCR检测：优先推荐QPCR检测RNA水平的沉默效果，推荐在24h到48h检测，可适当调整。QPCR检测沉默效果时，在设计引物时最好是将引物设计在沉默位点（靶序列）的两侧，而不是在同侧。因为RNAi引起的沉默是先进行mRNA的切割之后造成mRNA的降解。另外，即使设计在两侧，也不要离沉默位点（靶序列）太远的地方，不然可能会造成对沉默效果的低估。 WB检测：WB检测蛋白水平的沉默效果，一般在转染后48h到72h间提蛋白检测蛋白水平的沉默效果，检测时间跟目的蛋白的半衰期也有关系，具体的时间需要设计时间梯度，一般理想的是在72h最明显。

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