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内容来源：北京东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-12-01

rnai引物设计网站

siRNA转染实验步骤及要点详解 siRNA转染步骤：以EpFed转染试剂转染siRNA/质粒于24孔板，siRNA浓度为50nM为例。 1）储存液准备：siRNA使用前瞬时离心，用RNase-free H2O或灭菌ddH2O配制成20/L储存液，分装保存，避免反复冻融（建议不超过5次）。 2）细胞接种：贴壁细胞：转染前24小时接种0.5 - 2㗱05个细胞，转染时细胞融合度为30 - 50%。（铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长）悬浮细胞：转染前24小时接种0.5 - 2㗱05个细胞，转染时细胞数量应在4 - 8㗱05/孔。 3）转染步骤： A. 用25 ⵌ Opti-MEM（或不含抗生素和血清的DMEM培养基）稀释1.25⵬ siRNA（20/L储存液）/500ng质粒，并用枪轻轻吹打3 - 5 次混匀，再加入1.0 ⵌEpFed转染试剂，用枪轻轻吹打3 - 5 次混匀，不可Vortex或离心。siRNA转染细胞的终浓度为50 nM，室温孵育20分钟。 B. 按照24孔板每孔25ⵌ转染试剂-siRNA/质粒混合物，均匀加入到24孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。 C. 细胞板置于37℃、5% CO2培养箱中培养48-72小时。对于某些细胞对EpFed转染试剂比较敏感，可以在转染后4-6小时更换细胞培养液，转染效率无显著影响。 4）效果检测：转染完成后48-72小时均可进行沉默/过表达效果检测，最佳检测时间与细胞类型、转染试剂、检测目的等相关。 siRNA基因沉默效率的常见测定方法和注意事项： QPCR检测：优先推荐QPCR检测RNA水平的沉默效果，推荐在24h到48h检测，可适当调整。QPCR检测沉默效果时，在设计引物时最好是将引物设计在沉默位点（靶序列）的两侧，而不是在同侧。因为RNAi引起的沉默是先进行mRNA的切割之后造成mRNA的降解。另外，即使设计在两侧，也不要离沉默位点（靶序列）太远的地方，不然可能会造成对沉默效果的低估。 WB检测：WB检测蛋白水平的沉默效果，一般在转染后48h到72h间提蛋白检测蛋白水平的沉默效果，检测时间跟目的蛋白的半衰期也有关系，具体的时间需要设计时间梯度，一般理想的是在72h最明显。

circRNA实验全解 𐟔 实验原理在组织或细胞中提取的total RNA通常包含多种RNA。为了准确分析circRNA，首先需要去除样本中的核糖体RNA和poly-A RNA干扰，然后用RNase酶消化掉线性RNA，从而使circRNA富集。 𐟓Š 实验目的从总RNA中富集circRNA，采用Northern blot和特异的PCR进行验证，并对circRNA的成环特性进行评估。 𐟧ꠥꌦ料 RNA提取试剂盒核糖体RNA去除试剂盒 PolyA结合磁珠 RNAaseR试剂盒放线菌素D Northern blot试剂盒发散引物RT-PCR 𐟓 实验步骤 4.1 RNA提取样品处理组织样品：加入400ul Trizol溶液到装有绿豆大小组织块的EP管中，利用电动组织匀浆器在冰上充分匀浆1-2min，后放置室温充分裂解10min。细胞样品：12孔板细胞弃去上清，每孔加入600ul Trizol溶液。先在冰上裂解15-20min，再用1ml移液枪吹打液体充分裂解贴壁细胞，后将液体转移到RNasefree EP管中。 RNA提取按1:5比例，在Trizol溶液中加入氯仿，手动充分摇匀混合液20-30s，室温放置10min。 4度1200g离心10min，小心转移上层透明液体到EP管中。按异丙醇与Trizol溶液比例为1:2加入异丙醇，上下颠倒混匀液体，室温放置10-15min。 4度1200g离心10min，弃去上清，可见羽毛状RNA沉淀于管侧底部。按等比例加入75%乙醇，温和地悬浮RNA沉淀。 4度7500g离心5min，尽量吸除上清，室温晾干5-10min。用20ul RNase free dH20溶解RNA，测浓度后-80度保存。总RNA定量 RNA在260nm波长处有最大吸收峰，可通过测定RNA样品的OD260和OD280估算出RNA的含量和纯度。OD260值为1相当于40ug/ml单链RNA，该方法提取的RNA OD260/280值在0.8-2之间。 circRNA的预处理去除核糖体RNA和poly-A RNA 使用Invitrogen的核糖体RNA去除试剂盒RiboMinusTM Human/Mouse Transcriptome Isolation Kit（货号K1550-01）。通过磁珠法结合Poly(A)的RNA后剩余的RNA即为Poly(A)-RNA样品。 RNAaseR酶消化 RNase R是一类核糖核酸外切酶，能降解大部分线性RNA，但circRNA不易被RNase R酶消化降解。因此可以通过该实验鉴别circRNA和线性RNA。准备总RNA样品：提取细胞或组织的总RNA，测浓度后备用。 RNaseR反应体系：取5ug total RNA样品按下面体系准备消化。短暂旋转试管，添加5xFirst-StrandBuffer, 0.1MDTT, RNasin和SuperScriptM RT，轻轻移液并将反应液在25℃下孵育5分钟。在50℃下孵育60分钟，然后通过灭活反应在70℃加热15分钟。发散引物可以扩增circRNA，而不能扩增线性RNA。 𐟓š 参考文献 Chen et al. (2015). Isolation of non-polyadenylated and ribosomal-free RNAs from mammalian cells. Methods Mol Biol 1206, 69-80. Yang et al. (2016). Characterization of Circular RNA. Methods Mol Biol 1402, 215-227.

Cy5.5探针，四大妙用！ Cy5.5（Cyanine5.5）是一种荧光染料，因其较长的波长和较高的荧光稳定性，在DNA/RNA探针中有着广泛的应用。以下是Cy5.5在DNA/RNA探针中的四种主要应用：原位杂交 𐟧슥𐆃y5.5标记在DNA或RNA探针上，可以进行原位杂交实验。例如，将Cy5.5标记在一段与目标序列互补的DNA探针上，通过原位杂交可以观察到目标序列的存在和分布。这种技术常用于基因表达分析、基因组定位和细胞核酸定位等研究。荧光原位杂交（FISH）𐟔슃y5.5也可以用于荧光原位杂交实验。例如，将Cy5.5标记在一段与目标RNA序列互补的DNA探针上，通过荧光原位杂交可以直接观察到目标RNA的存在和分布。这种技术有助于研究基因表达调控、细胞核酸定位和染色体结构等。全基因组筛选 𐟧 将Cy5.5标记在全基因组引物上，可以进行全基因组筛选实验。例如，将Cy5.5标记在一组引物上，通过PCR扩增所有基因组的DNA，并进行荧光检测，可以识别特定的基因组序列。这种技术常用于基因组分析、SNP检测和位点筛选等。 RNA干扰（RNAi）⚗️ Cy5.5还可以用于RNA干扰实验。例如，将Cy5.5标记在siRNA或shRNA上，通过RNA干扰技术可以特异地抑制目标基因的表达，并通过Cy5.5的荧光信号进行检测和验证。这种技术有助于基因功能研究、基因调控和疾病治疗等。通过将Cy5.5标记在DNA或RNA探针上，可以实现对特定基因序列或RNA分子的检测和可视化。这种应用可以帮助研究人员了解基因表达、基因组结构和细胞核酸定位等。结合不同的实验技术和分析方法，可以实现对特定基因或RNA序列的定位、筛选和功能研究。相关染料 𐟌ˆ 花氰染料CY5.5-羧基 (CY5.5-COOH) 花氰染料CY5.5-氨基 (CY5.5-NH2) 花氰染料CY5.5-活性酯 (CY5.5-NHS)

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